西湖大学马丽佳团队技术开发In-library Ligation策略，促进联合免疫治疗靶点高通量筛选

译者：生物体世界

加强内皮细胞内功能是多种病原体疗法的两大，如针对病原体均会的抗体药、在体外进行 T 细胞内工程化大修的 CAR-T 疗法等。近年来，重新组建病原体疗法正在试着同时类似物多个有所不同功能的病原体抑制蛋白来增强内皮细胞内的抗甲状腺灵活性，并取得亮眼的成效。例如，在乳癌和非小细胞内肺癌的临床试验里面，重新组建 PD-1 胺和 CTLA-4 胺化疗较使用举例来说病原体均会胺明显地延长了受试患者的生存期。

与内皮细胞内抗甲状腺灵活性类似，复杂生物体的细胞内表现型通常都是由多个等位基因重新组建作用产生。在许多情况下，冲击单个等位基因很难显现出来感兴趣的表现型。例如，三组转录特异性相互作用能促进肺癌成效里面的侵袭-转移；又例如，不止一种细胞内表面会介导参与病毒对的细胞内侵袭，因此阻断举例来说介导很难保护寄主细胞内免受感染。

黄山学院生命科学学院 马丽佳技术开发团队关心 究竟可以基于 CRISPR 等位基因编辑两大技术，新设计出一种只能高通量检验影响细胞内表现型的多等位基因复合的两大技术。 已对，马丽佳技术开发团队在 Nucleic Acids Research季刊在线刊发了题为： An in-library ligation strategy and its application in CRISPR/Cas9 screening of high-order gRNA combinations 的研究论文。 该研究技术开发了一种高通量的核酸连结策略——In-library Ligation，可以在日文版内将上万条 DNA 片断按既定新设计进行匹配连结。在合成片断间隔一定的条件下，In-library Ligation 可以高通量地延长有机体DNA片断的间隔，容纳不够多的目标序列用于南岸运用。

In-library Ligation 的新设计两大在于结合了生物体信息学序列新设计和对病毒学切口酶的灵活运用。只能在日文版里面的 DNA 片断上，重构出具有足够确定性的超长黏性末端，使得成千上万的片断只能在一个反应框架里面以而无须新设计好的顺序和复合高效率配对。 技术开发团队将 In-library Ligation 两大技术运用于重构 CRISPR 检验日文版。他们首先针对1599个等位基因在各种信号通路里面的特有种，重构了6236个4 gRNA 复合，每个复合类似物1599里面等位基因里面的4个，他用经典的 Jurkat 细胞内体外酪氨酸实验有效性了 In-library Ligation 两大技术在 CRISPR 日文版检验里面的可行性。

随后，技术开发团队又针对六种病原体均会等位基因，重构了类似物1个、2个、3个或4个病原体均会等位基因的所有可能的 gRNA 复合，并包装为 CRISPR 慢病毒日文版，等位基因编辑激素原代 CD8+T 细胞内。等位基因编辑后的工程化 T 细胞内被注射到荷瘤激素体液重构甲状腺杀伤建模。技术开发团队发现，在浸润入甲状腺的T细胞内个体里面，敲除了有所不同病原体均会复合的工程化T细胞内体现出有所不同的富集畸变。其里面，同时敲除了 Pdcd1，Adora2a 和 Ctla4 三个等位基因（亦称PAC）的工程化 T 细胞内体现出比其他 T 细胞内不够高的活性。在近期的有效性里面，敲除了 PAC复合的 T 细胞内还体现出了不够突出的遏制甲状腺大小的灵活性，并延长了荷瘤激素的生存期。

总之，In-library Ligation 两大技术为高通量、高确定性、可控的 DNA 片断连结提供了解决方案，可运用于 CRISPR 日文版重构、长片断 DNA 日文版合成等运用过场。通过 In-library Ligation 重构 CRISPR 日文版检验出的 PAC 复合，为类似物多个病原体均会的重新组建病原体化疗、重构增强型 CAR-T 细胞内提供了新思路。

黄山学院博士生陆志科、博士后倪科，博士生王颖盈是论文的合作第一译者，黄山学院马丽佳任教是论文的通讯译者。

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